ROS1融合基因檢測要點，一文理清

干貨滿滿~

近年來，隨著肺癌分子生物學機制研究的不斷深入和靶向治療的發展，已有10余種驅動基因在肺癌中被發現，除了EGFR、ALK等人們熟知的基因突變，ROS1這一罕見驅動基因也逐漸走入人們的視線。ROS1變異主要為ROS1基因與其他基因發生斷裂融合，多發生在NSCLC（非小細胞肺癌），陽性率約為1%-2%[1]。ROS1融合陽性NSCLC年齡偏小（中位年齡49.8歲），多為女性、從未吸煙/輕吸煙者患者，且主要發生的組織類型為腺癌[2]。

成功檢測出ROS1融合基因是合理治療的關鍵，也是對其進行個體化治療的前提[3]。目前針對ROS1融合基因的常用方法有4種：熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription- poly merase chain reaction，RT-PCR）及二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）[4,5]，且在臨床實踐中各有優劣。

FISH是目前檢測腫瘤組織中染色體重排最有效的診斷技術之一，不僅可以檢測已知的融合突變，也可以檢測未知的融合突變，而且結果具有可靠性及穩定性，也是目前檢驗其他檢測技術準確性的最重要的手段。

ROS1融合基因檢測采用分離探針試劑設計。ROS1分離探針包括兩部分，一部分識別分離點5’ 端（端粒）附近點基因序列，另一部分識別融合分離點3’ 端（著絲粒）附近點基因序列。３′端探針通常 被標記成綠色，５′端探針標記為橘紅色或紅色。

當樣本中≥15％細胞出現分離信號形態（紅色和綠色信號分離）或者單一3’信號形態（單獨綠色信號）診斷為ROS1基因融合陽性。但因檢測成本較高、需要專業設備及人員、試劑昂貴、熒光信號消減迅速等缺點，限制了該法的廣泛應用。

圖1a為ROS1基因融合陰性形態（正常：紅綠信號融合）；圖1b為ROS1陽性分離信號形態（紅色和綠色信號分離）；圖1c為ROS1陽性單一3’信號形態（單獨綠色信號）[6]。

RT-PCR檢測具有靈敏性高、特異性強、簡便快速的特點，在實驗室中應用更為廣泛，可檢測所有融合型但不能區分融合類型。

目前，對于ROS1 PCR檢測多數采用real-time RT-PCR技術。real-time RT-PCR技術是RNA逆轉錄cDNA和熒光定量PCR擴增相結合的一種技術，首先經逆轉錄酶和特異性引物作用下，將RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板擴增目的片段。該技術在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過Ct值對未知模板進行定性和定量分析直接檢測基因融合狀態的一種方法。

目前，國家食品藥品監督管理局（NMPA）已經批準多個ROS1陽性NSCLC的real-time RT-PCR診斷試劑盒，包括廈門艾德生物醫藥科技有限公司的人類ROS1基因融合檢測試劑盒（RT-PCR 法）和武漢友芝友科技有限公司的人類ROS1基因融合檢測試劑盒（RT-PCR 法）[4]。

圖2為艾德生物人類ROS1基因融合檢測試劑盒（RT-PCR技術），適用檢測樣本包括新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織等[7]

IHC可作為常規ROS1融合基因的篩選手段。與FISH技術相比，IHC成本低，快速準確，臨床應用更為廣泛。IHC檢測通過顯色劑標記抗體，利用免疫反應的特異性來確定抗原。

在NSCLC患者中，目前可用于ROS1融合基因篩選的抗體主要為D4D6（Cell Signaling Tech公司），檢測ROS1融合蛋白的靈敏度和特異度分別達到了100％和 85％-100％。因為使用IHC進行ROS1檢測，操作方法、判讀標準也不統一，導致各檢測中心的檢測結果存在較大的波動性。

我國《ROS1陽性非小細胞肺癌診斷病理專家共識》評判標準如下：

• IHC 3+: >10%的腫瘤細胞呈現深棕色強著色；

• IHC 2+：>10%的腫瘤細胞呈現棕色著色；

• IHC 1+: >10%的腫瘤細胞呈現微弱棕色著色，且無任何背景染色；

• IHC 0：腫瘤細胞無明顯著色或≤10％微弱棕色著色[4]。

IHC檢測的強陽性與RT-PCR/FISH檢測陽性之間存在高度的一致性，但中度陽性及弱陽性與RT-PCR/FISH檢測陽性之間一致性較差。對于IHC 1+以上的患者，建議使用RT-PCR/FISH進行ROS1融合基因的確診。

圖3：深棕色強著色（IHC 3+)，且ROS1 FISH檢測也確診為陽性（紅色和綠色信號分離）[8]

NGS又稱高通量測序，廣泛應用于醫學領域中腫瘤的預防、檢測及治療，能夠準確檢測已知的基因及其他基因的突變。

NGS分為基于DNA的NGS或基于RNA的NGS和基因擴增的NGS與雜交捕獲的NGS，操作流程復雜，包含雜交捕獲、建庫、測序、數據分析、變異注釋等流程。

NGS對于操作人員及操作環境的要求高，檢測周期長（針對涵蓋基因數量不同的檢測panel，需3 d-10 d出報告），但NGS檢測技術具有其不可替代的優勢：一個平臺一份樣本即可得到多個基因檢測結果，而需要多個技術平臺，多份樣本；NGS能檢測未知基因變異，而傳統檢測技術未能檢測未知融合。相比傳統基因檢測方法，NGS檢測有明顯的技術優勢。但傳統基因檢測方法因臨床可及性高和單次檢測成本較低而在臨床應用廣泛[9,10]。

表1：ROS1融合基因不同檢測方法的比較一覽表[2]