來源： 探癌

盧煜明院士最近在Journal of Hepatology上發表了一篇關于肝癌液體活檢的綜述，在該篇綜述中討論了液體活檢中cfDNA的發展，生物學特征， 以及它們用于肝細胞癌檢測、監測和管理的潛在臨床應用等

背景

術語“液體活檢”常用于指血漿和其他體液（如胸水、腹水和腦脊液）中循環無細胞DNA（cfDNA）的分析，但它也包括對血液中循環腫瘤細胞（CTCs）和其他核酸（如RNA和microRNA）的分析。血液中CTCs以非常低的濃度存在，通常每毫升血液少于10個CTCs，甚至在患有轉移性疾病的患者中也是如此。每毫升血液中有大約1000萬個有核細胞，換算下來就是一百萬個有核血細胞中CTCs將少于1個。這種低濃度特征極大地限制了CTCs的診斷分析潛力。例如，Yu et al.表明在可手術的肝細胞癌（HCC）患者中，每7.5ml血液中平均只有1.15個CTCs。與每7.5 ml血液中＜2個CTCs的患者相比，每7.5 ml血液中≥2個CTCs的患者其無病生存期和總生存期較低。與CTC相比，cfDNA由癌細胞貢獻的比例顯著更高。Cai et al.研究表明，在晚期HCC患者中，攜帶癌癥特異性突變的DNA片段可占cfDNA的50％以上。也正因為cfDNA中源自腫瘤的DNA比例比有核血細胞中CTCs的比例高，使得cfDNA的分析比CTCs更廣泛地應用于癌癥的管理。

從早期癌癥的篩查到晚期癌癥患者的治療指導，液體活檢越來越多地用于癌癥患者的管理。研究者也積極探索液體活檢用于治療肝癌的潛在應用，希望克服常規腫瘤標志物（主要是蛋白質或糖蛋白）的局限性。已在多種癌癥患者的cfDNA中檢測到癌癥相關的突變，包括單核苷酸突變（SNVs）、拷貝數改變（CNAs）、甲基化改變和DNA片段化模式改變，其在HCC患者管理中具有潛在的臨床應用（圖1）。

圖1. HCC管理中的液體活檢概述

cfDNA分析的發展史

首次發現人體血液中細胞外核酸的存在可以追溯到1948年， 在隨后的幾十年中cfDNA分子的生物學特性和診斷應用在一直都在積極進行。Leon et al. 的研究表明癌癥患者的cfDNA濃度高于健康人的濃度，這激勵了研究人員研究cfDNA在腫瘤學中潛在的應用。隨著PCR的技術的發展，在癌癥患者的cfDNA中檢測到腫瘤相關的基因突變和微衛星改變。1997年，受到癌癥患者血液中存在腫瘤衍生的cfDNA啟發，Lo et al. 發現cffDNA（cell-free foetal DNA）存在于孕婦的血漿和血清中。這一發現為基于cfDNA的NIPT發展鋪平了道路。每年有數百萬孕婦使用NIPT，這種基于cfDNA的胎兒染色體非整倍體無創產前檢測改變了臨床實踐，是cfDNA技術的首次成功應用，并已在數十個國家推行。實際上，ctDNA（循環腫瘤DNA）和cffDNA（循環胎兒DNA）之間的多重相似性激發了腫瘤和產前這2個領域的許多類似發展。在這些發展的推動下，全球的研究者對在其他領域使用cfDNA進行液體活檢的興趣濃厚，特別癌癥檢測和監測領域。多種類型癌癥相關分子實體（包括SNVs、CNAs、易位、甲基化學改變、基因表達改變和病毒DNA）已在無細胞核酸中檢測。

cfDNA的生物學特征

有許多研究工作集中在cfDNA的生物學特征上。大多數cfDNA分子是小于200bp的短片段。Chan et al. 使用了一系列不同大小的擴增子進行PCR發現鼻咽癌患者中超過90％的ctDNA片段大小低于180bp。對cfDNA進行雙端測序的研究發現，在健康個體以及不同疾病/生理條件（包括癌癥、妊娠和自身免疫疾病）個體的cfDNA大小分布中，均觀察到166bp的峰存在。源自于腫瘤的DNA片段長度比源自非惡性組織的DNA的短。源自于胎兒的cfDNA片段長度比源自孕婦本身的短。這些特征被認為與DNA的核小體包裝和與組蛋白的相互作用有關。對這種碎裂模式的研究可稱為“片段化組學”（fragmentomics）。

Snyder et al.推斷核小體結構與基因表達之間存在關聯，因此使用來自基因組不同部分的血漿DNA分子頻率構建了全基因組核小體圖譜。由于基因表達譜在不同的組織類型中存在差異，Snyder et al.能夠使用其核小體圖譜推斷出不同組織對血漿中cfDNA的貢獻，并表示這種方法可提供晚期癌癥患者腫瘤的解剖學信息。例如，來自IV期HCC患者的血漿DNA核小體圖譜顯示出與HCC細胞系（HepG2）基因表達譜的最高相關性。Chan et al. 進一步報道了cfDNA的片段化是非隨機的，并且有一些基因組區域在cfDNA末端存在富集的情況，并稱這些cfDNA為“cfDNA偏好性末端”（cfDNA preferred ends），表明偏好性末端的基因組位置實際上反映了特定cfDNA片段起源于的核小體模式。如，具有胎盤DNA偏好性末端的cfDNA片段的比例與孕婦血漿DNA中的胎兒DNA的比例正相關。Jiang et al. 確定了一組偏好性末端位點，這些位點似乎優先與HCC相關，通過使用這些位點，可以增強檢測血漿DNA中HCC相關突變的穩定性。這種新興技術的原理如圖2所示。

圖2. 鑒定cfDNA末端特征的原理示意圖

用于cfDNA分析品制備的策略

影響液體活檢準確性的一個關鍵因素是由癌細胞貢獻的cfDNA的比例。由于cfDNA的濃度遠低于血細胞的數量，因此來自血細胞的DNA的污染將顯著稀釋血漿樣品中的腫瘤衍生的DNA濃度，從而影響下游分析。兩種方法可使cfDNA中來自血細胞DNA的污染最小化。（1）盡量減少血液采集和儲存期間血細胞的溶解；避免采血期間的溶血，明顯溶血的血液樣品不適合cfDNA分析；血液樣本應在收集后6小時內處理，以便從血細胞中分離出血漿，因為既往研究表明超過6小時延遲處理會導致血細胞釋放大量DNA；在過去幾年中，發展出專門用于cfDNA分析的血液采集管，這些血液采集管含有穩定血細胞的添加劑，使得血液中血細胞DNA的釋放最短可達6天。（2）確保從血漿中徹底清除血細胞；通常采用雙離心方案，即先將血液樣品低速離心，分離血漿與血細胞；然后對收集的血漿高速離心，去除血漿中殘留的血細胞。

液體活檢在肝癌治療中的臨床應用

與cfDNA在HCC管理中的臨床應用包括：診斷和篩查、風險預測、治療指導，以及預后監測。

(1）診斷和篩查

HCC是全球第六大常見癌癥，但卻是癌癥相關死亡的第二大原因。HCC預后不良的一個關鍵原因早期HCC相對無癥狀，大多數患者在確診時已是癌癥晚期。在這方面，液體活檢可用于HCC的監測和診斷。Liao et al. 使用基于擴增子的測序來研究HCC患者中涵蓋3個基因（TERT、CTNNB1和TP53）上的22個熱點突變。研究對41例（其中38例為HBeAg陽性）HCC患者的血漿樣本進行分析，19.5％（8例）的患者至少攜帶1個腫瘤相關突變；TERT、CTNNB1和TP53基因上熱點區域的突變分別僅在3.9％、7.8％和3.9％的HCC患者中被發現，這表明通過擴大靶向區域來檢測基因突變可以提高敏感性。然而，當擴大突變的分析范圍時，有6個對照樣本在這3個基因上至少攜帶1個突變。這些結果表明，如果想確定一位患者是否僅患有癌癥，其檢測方法的敏感性和特異性都會面臨重大挑戰。同時，大多數在克隆性造血過程中發生突變的個體在其一生中可能不會得癌癥，與年齡相關的克隆性造血體系突變可能對cfDNA突變分析的特異性產生不利影響。

為了提高早期癌癥檢測整體的敏感性和特異性，Cohen et al.將基于UMI的突變檢測和8種常規蛋白生物標志物（如CA125、CEA、癌抗原19-9、催乳素、肝細胞生長因子等）整合到風險評估測試CancerSEEK中。他們共分析了患有8種常見癌癥的1,005名患者和812名健康對照者。8種常見癌癥（卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、結腸直腸癌、肺癌和乳腺癌）的中位總敏感性為70%，特異性為99％；其中98％（43/44）的肝癌患者被檢測到。與其他癌癥類型相比，這些初步數據表明CancerSEEK在檢測肝癌方面表現更好。在慢性乙型肝炎攜帶者和肝硬化患者中驗證該檢測的特異性非常重要，因為大多數（70％~80％）HCC患者與乙型肝炎感染有因果關系。

Chan et al.使用全基因組測序表明可在cfDNA和配對的腫瘤組織中檢測到一致的拷貝數變異和突變。該觀察結果表明，由源自腫瘤的突變可用于監測患者的臨床進展和治療后殘留病灶的檢測。在一項隨訪研究中，研究者發現84.4％（76/90）的HCC患者在其血漿中1號和/或8 號染色體存在CNAs。這些CNAs的檢出率在有和沒有肝硬化的乙型肝炎攜帶者中分別為22.2％和4.5％。2名檢出CNA的肝炎患者，在采血時HCC狀態未知，但在3~4個月后被診斷為HCC，這表明CNA分析可能對HCC的監測或篩查有用。

Wong et al.等使用甲基化特異性PCR表明在HCC患者血液中容易檢測到CDKN2A（編碼p16）和CDKN2B（編碼p15）甲基化異常。RASSF1A高甲基化分析對HCC患者檢測具有70~93％的敏感性。cfDNA分子中異常的甲基化信號使得能夠檢測AFP陰性的HCC。最近，研究顯示通過更多的甲基化標志物可以提高診斷準確性。Xu et al.在383個HCC和275個正常樣本的隊列中對1,000個標志物進行分析發現其靈敏度達到83.3％，特異性達到90.5％。Chan et al. 將全基因組低甲基化與CNA相結合，區分可進行手術的HCC患者和慢性乙型肝炎攜帶者的敏感性為92％，特異性為88％。

目前可使用諸如蛋白質標志物和各種成像方式對腫瘤進行溯源。但探索“血漿DNA組織定位”（plasma DNA tissue mapping）——使用cfDNA進行腫瘤的組織溯源有利于將來的研究。對全基因組甲基化組學分析血漿DNA組織定位可用作“全身分子成像”的方法，用于鑒定在cfDNA中檢測到的突變的潛在組織起源（圖3）。

圖3. 血漿DNA的甲基化分析

血漿DNA由源自不同組織/器官中細胞死亡和細胞凋亡過程中產生DNA分子組成。組織特異性甲基化特征或癌癥相關甲基化變化可以反映在癌癥患者的血漿DNA中。經亞硫酸氫鹽處理后，原 DNA 樣本中的胞嘧啶 (C) 可轉化為尿嘧啶 (U)，而 5-甲基胞嘧啶脫氨基轉化為尿嘧啶的幾率極低，所以，亞硫酸氫鈉處理后再進行PCR的產物中，胞嘧啶只來自于 5-甲基胞嘧啶。這種方式可有效保留DNA的甲基化信息，被廣泛使用于特定位點和全基因組的甲基化檢測。

（2）HCC的風險預測

在cfDNA中可以檢測到在HCC早期階段發生的癌前基因和表觀遺傳改變。Wu et al. 分析了237例HCC患者及其相匹配的cfDNA 樣本中6個基因（CDKN2A、RASSF1A、STEAP4、TBX2、VIM和ZNF154）的甲基化水平，發現cfDNA中TBX甲基化的存在與未來HCC發生的風險增加相關，其OR=5.35 。除了cfDNA外，Huang et al.鑒定了一組由16種miRNAs組成的miRNA特征，這組miRNAs可以預測慢性丙型肝炎攜帶者發生HCC的風險。

（3）指導治療決策

cfDNA分析的一個重要應用是指導治療決策，特別是在靶向治療這塊。例如，使用液體活檢分析EGFR突變已被廣泛應用于指導EGFR-TKIs的使用。許多研究已證明可以在HCC患者的cfDNA中使用靶向大規模平行測序鑒定癌癥相關的驅動突變。進一步研究顯示cfDNA的突變特征反映了相應腫瘤組織中的狀態。目前，對HCC患者的基因突變分析不是指導治療決策的常規方法，其原因有兩個：（1）只有7種批準用于HCC全身治療的藥物（包括作為晚期HCC一線治療的sorafenib 和lenvatinib；作為疾病進展的HCC患者二線治療的regorafenib、cabozantinib、ramucirumab、nivolumab和pembrolizumab）；（2）sorafenib 和lenvatinib的治療反應與特定基因突變無關。

當然也不能低估cfDNA突變分析用于HCC管理的潛力。大多數HCC靶向治療臨床試驗未能證明結果的顯著性或滿足其主要終點的一個關鍵原因是HCC患者在病因學和分子病理機制方面的異質性。液體活檢為晚期HCC患者的突變譜的大規模評估提供了一種非侵入性方法。這可用于鑒定對治療藥物有反應的患者亞組以及更可能發生嚴重藥物不良反應的患者亞組。

近期研究已經顯示在多種實體瘤中TMB能夠預測患者對免疫療法的臨床反應。基于cfDNA的TMB檢測可用于預測非小細胞肺癌患者對PD-L1免疫抑制劑atezolizumab的治療反應，無論PD-L1表達如何。基于cfDNA的TMB是否有助于預測HCC患者對免疫治療的反應是值得探討的問題。

（4）預后監測

癌癥衍生的CNAs、突變和甲基化改變可用于監測HCC治療后的疾病進展。在一項涉及4名患者的概念驗證研究中，Cai et al.對手術切除的HCC腫瘤組織樣本進行了574個癌癥相關基因的測序，并鑒定了204~253個突變，且發現使用捕獲測序，相應患者的cfDNA中可檢測到超過98％的這些突變，并且這些突變的豐度與患者的臨床狀態呈正相關。Garcia-Fernandez et al. 研究還表明，在肝移植治療HCC患者cfDNA中檢測到的p53突變與腫瘤復發相關。

在Xu et al.研究中，基于10個甲基化標記的cfDNA甲基化評分從HCC I期到IV期逐漸增加，并且在腫瘤切除后下降。與臨床緩解患者相比，在疾病進展的患者中觀察到明顯更高的評分，表明該方法可潛在地用于監測患者進展和殘留病灶檢測。

總結

在HCC患者的cfDNA中越來越多地報道存在與癌癥相關的突變，包括單核苷酸突變、CNAs和甲基化異常。最初的探索性研究報道，使用多種標志物或基因和表觀遺傳方法的組合可以實現檢測HCC的合理靈敏度和特異性。由于大多數現有研究報道都是回顧性病例對照研究，因此一個重要的考慮因素是對照的選擇。在HCC發病率高的地區，例如東南亞，風險群體是那些患有慢性乙型肝炎/丙型肝炎感染和/或肝硬化的人群。因此，這些試驗在慢性肝炎和/或肝硬化患者中的特異性是最相關的。此外，需要進一步評估這些測試的應用是否可以改善臨床結果。最近，一項關于鼻咽癌篩查的大規模前瞻性試驗表明，cfDNA分析可用于鑒別早期無癥狀癌癥，從而提高生存率。這類研究有助于確定液體活檢在HCC監測中的作用。由于HCC是一種相對異質性的疾病，具有多種病因和致癌驅動事件，使用cfDNA突變進行分析也可更好地表征患者，這對于優化患者的治療和評估藥物試驗中不同治療選擇的療效具有重要作用。

參考文獻

NCCN臨床實踐指南：肝膽腫瘤（2019.V2）.

#醫師報超能團#

#超能健康團#

想了解癌癥的科普、預防及治療，癌癥心理咨詢等，請搜索我們的三個公眾號：1，女性癌健康；2，植物硒教授；3，癌友群，關注了解。